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最新观点| 肠道菌群改善肝脏炎症微环境减少肝细胞癌发生

作者:吴娜、张勇

肝细胞癌(HCC)是肝癌的一种病理类型,是一种高死亡率的原发性肝癌。HCC 经常出现在慢性肝病 (CLD) 的背景下,表现为慢性肝脏炎症和持续的肝损伤导致肝细胞死亡,从而促进代偿性增殖并先于肝癌发生。近年来,慢性疾病、现代生活方式环境、西方饮食因素以及药物治疗已被发现会让肠道生态失调,这些因素改变肠道菌群构成,并直接影响机体炎症状态。由于肝脏通过门静脉不断地暴露于来自肠道的大量微生物代谢衍生物,肠道稳态的变化直接影响肝脏的生理机能。随着微生物组学的发展,益生菌的出现为治疗HCC提供了一种新思路,但益生菌如何调节肠道菌群平衡,改善肝脏炎症微环境却未得到探索。

2022年7月8日,来自德国亚琛工业大学的 Trautwein在Nature Communications上发表题为“Imbalanced gut microbiota fuels hepatocellular carcinoma development by shaping the hepatic inflammatory microenvironment”的文章,该文章提出肝硬化患者肝组织中细菌丰度增加,可引起明显的转录变化,包括激活纤维-炎症通路以及介导癌症免疫抑制的回路,揭示了肠道菌群可重塑肝脏炎症微环境,也为癌症预防和治疗开辟了一种新途径。

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Nlrp6炎性小体是肠道中维持宿主-微生物稳态的重要调节因子,研究人员将肝癌模型小鼠NEMOΔhepa与Nlrp6-/-小鼠交配得到NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠,且52周龄的NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠显示出更高的肿瘤负荷,肝脏/体重比也明显增加,同时NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠血清中丙氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、碱性磷酸酶和胆红素水平升高,肝损伤增加。肝切片染色显示NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠均表现出明显的免疫细胞浸润,促纤维化基因Tgfβ和Collagen1a1的mRNA表达水平升高进一步证实肝纤维化,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中CD11b+细胞数量显著增加;当NLRP6缺失时,CD8+T细胞减少。52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的炎症表型与pJNKd的显著激活相关,这与裂解Caspase3染色和代偿性增殖显示的凋亡性肝细胞死亡增加相关。综上,这些结果表明Nlrp6缺失重塑NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肿瘤微环境的炎症反应,并推动肝脏疾病向纤维化和癌症发展(图1)。               

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图1.  Nlrp6缺失促进NEMOΔhepa小鼠肝病进展

研究人员采用16S rRNA基因扩增子测序分析13周龄和52周龄NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠以及对照组WT和Nlrp6-/-小鼠的盲肠微生物群组成,比较了小鼠之间肠道菌群组成的差异。基因型、饲养笼、NEMOΔhepa基因型和小鼠品系解释了13周龄小鼠中微生物群总变异的很大比例(图2a),NEMO条件性缺失以及所导致的脂肪性肝炎对肠道微生物群组成仍有可重复的影响。β多样性分析证实也了Nlrp6-/-品系中独特的微生物群。根据DESeq2和LEfSe差异丰度结果,与WT小鼠相比,Nlrp6-/-小鼠中Roseburia和Lachnospiraceae减少,NEMOΔhepa中Akkermansia增加。

为了以探索菌群变化对肠道功能的影响,研究人员进一步分析了结肠粘液层,结果显示Nlrp6的缺失与结肠粘液层变薄相关,且在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中最为明显,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的回肠和结肠组织裂解物中闭锁蛋白以及occludin蛋白表达均降低。TJ屏障的破坏与炎症基因mRNA表达增加以及回肠组织中CD11b+细胞浸润增加也是有关的。总之,这些结果显示Nlrp6缺失会使NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道菌群失调,Nlrp6表达缺失也会引起肠道生态失调促使肠道TJ屏障破坏,炎症基因表达增加。

接下来研究了NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道生态失调和肠道屏障损伤对肠道功能的影响。发现NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠通透性明显增加,ALT水平和肿瘤数量与肠道通透性密切相关,表明肠道屏障受损加剧NEMOΔhepa小鼠的肝脏疾病(图2)。

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图2. Nlrp6缺失导致肠道生态失调和与脂肪性肝炎活性和肿瘤负荷相关的肠道屏障受损

与肝癌模型NEMOΔhepa小鼠相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的ALT、AST和GLDH水平显著增加,表明肝损伤更为严重,且肝脏/体重比以及小鼠星状细胞活化显著增加。肠道生态失调和屏障受损促进MAMPs通过门静脉进入肝脏,从而激活由病原体识别受体(PRR)介导的先天免疫反应。与NEMOΔhepa小鼠相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中CD45+白细胞浸润显著增加。值得一提的是,mMDSC丰度与ALT水平密切相关,表明它们介导NEMOΔhepa小鼠肝损伤;而且由结果可知,mMDSC在癌症发展中对T细胞具有明显抑制效应。此外,在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中观察到M2标志物Arg1表达增加,而M1标志物Nos2表达降低,表明这些小鼠中存在促肝癌微环境。

研究人员为了充分定义MDSCs进行了额外的染色和功能分析,以进一步确定细胞表型。CD11b+ mMDSCs和CD8+T细胞非常接近,接下来,分离并进一步表征了这些细胞,并通过体外实验检测其对T细胞的抑制能力。结果显示mMDSCs明显抑制CD8+ T细胞增殖,且在与NEMOΔhepa/Nlrp6-/- mMDSCs共培养时抑制效应最明显。这些结果说明,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道生态失调与mMDSCs扩增密切相关,且NEMOΔhepa/Nlrp6-/- mMDSCs具有更强烈的抑制效应。总之,NEMOΔhepa/Nlrp6-/- mMDSCs可在体外抑制T细胞增殖。

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图3. mMDSCs促进NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠脂肪性肝炎进展

由前面的结果可知,A. muciniphila在13周和52周龄的NEMOΔhepa/Nlrp6-/-以及接受FMT的NEMOΔhepa小鼠中显著减少(图2b)。A. muciniphila的相对丰度与肝脏mMDSC丰度以及血清ALT和GLDH水平呈负相关,表明这些细菌在介导表型中的相关性。通过对灌胃5周前后的粪便样本进行RT-qPCR和16S rRNA基因扩增子测序,证实了成功的微生物群移植,AKK处理不仅增加了这种特定细菌的丰度,而且导致微生物群组成发生显著变化,A. muciniphila处理解释了在这些小鼠中观察到的微生物群总变异的很大比例。LEfSe分析显示拟杆菌门减少,Akkermansia增加。DESeq2分析显示,补充Akkermansia还导致Lachospiraceae和Blautia丰度增加。A. muciniphila灌胃后,Occludin蛋白水平显著增加。经A. muciniphila灌胃的NEMOΔhepa小鼠中,肝损伤标志物(ALT、AST、LDH和GLDH)的血清水平明显降低。最后,探究在Nlrp6-/-生态失调模型中是否可以改善肝脏疾病的进展。A. muciniphila处理后可降低NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝损伤,这与骨髓CD11b+细胞浸润显著减少和SR染色证明的肝纤维化降低有关。这些数据共同表明,即使存在促进生态失调的宿主因素(如Nlrp6缺失),持续补充A. muciniphila也可以减少肝损伤、炎症和纤维化(图4)。

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图4.  补充A. muciniphila可改善NEMOΔhepa小鼠的肝脏疾病

基于小鼠数据,研究人员专门研究了细菌易位对人类肝硬化肝脏炎症环境的影响。结果显示,肝硬化表现出整体免疫细胞和基质细胞的富集,而肝细胞评分相对降低。包括编码PD-1的PDCD1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA4)在内的几个免疫检查点基因显示出与16S rRNA丰度的强相关性。与这些研究结果一致,胸腺细胞选择相关基因TOX、IRF4以及REL和BACH2(指导人类癌症中的T细胞耗竭和免疫抑制)与16S rRNA 基因丰度高度相关。MDSCs是MAMPs和PAMP的重要传感器,可能抑制T细胞功能。MDSC标记集落刺激因子受体2a(CSFR2A)和白细胞介素1受体2(IL1R2)的表达水平均与16S rRNA基因丰度密切相关。总之,这些数据表明,肝硬化宿主的细菌易位与纤维炎症通路以及与免疫抑制和T细胞耗竭相关的转录因子激活密切相关。

总之,基于小鼠模型和临床研究数据,表明肠道菌群直接影响肝脏炎症微环境。NEMOΔhepa/Nlrp6-/- 小鼠的失调不良菌群可传播至NEMOΔhepa小鼠,通过促进mMDSCs和抑制CD8+T细胞加剧肝脏疾病进展。重要的是,通过调控肠道菌群重塑炎症微环境,为微生物群靶向治疗提供了合理的依据。肝硬化患者的肝组织微生物群与肝转录组特征的关联仍需要大规模的研究来评估其诊断应用。

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-022-31312-5

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