作者：张艺彤、张勇
炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种引起结肠和小肠长期炎症的疾病，它的发病机制已被报道与肠道黏膜屏障功能受损和肠道微生态失调有关。IBD的医学干预主要包括氨基水杨酸盐、抗生素、皮质类固醇和免疫抑制剂等。然而，这些药物大多不能从根本上解决肠黏膜损伤、肠屏障功能受损和肠道菌群失衡等问题。此外，长期使用这些药物容易引起严重的不良反应，包括恶心、头痛、痤疮、水肿和鼻咽炎等。因此，需要研发新的药物既能减轻副作用，又能从根本上治疗IBD。
2022年6月，来自苏州大学的陈倩教授和刘庄教授在Nature Communications发表了“Programmable probiotics modulate inflammmation and gut microbiota forinflammatory bowel disease treatment after effective oral delivery”的文章，通过基因工程技术对益生菌Escherichia coli Nissle 1917 (ECN)进行改造，使其过表达过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）（图1c），这两种酶已被证明可有效清除IBD患者炎症部位的活性氧（ROS），从而达到治疗IBD的效果。人体胃肠道中的胃液和胆盐通常会降低益生菌的存活率，我们采用壳聚糖和海藻酸钠作为生物膜，通过逐层静电自组装方式包裹ECN-pE (ECN(pET28a-T5-CAT-SOD))，形成了ECN-pE (ECN-pE(C/A)2)（图1a），与临床使用的肠粘膜涂层Eudragit L100-55相比，对益生菌保护作用更强（图1b）。在不同化学致炎剂诱导的IBD小鼠模型中， ECN pE(C/ A)2能有效缓解炎症，修复结肠上皮屏障，调节肠道微生物平衡，提高肠道菌群中Lachnospiraceae_NK4A136和Odoribacter的丰度，维持肠道内稳态。因此，本研究为开发益生菌治疗肠道相关疾病的活性治疗奠定了基础。
图1. 治疗IBD的工程益生菌
通过透射电子显微镜（TEM）成像技术研究工程益生菌ECN pE(C/ A)2在人工胃液（SGF）或4％胆汁酸的模拟胃肠道环境中的生存情况，发现经过SGF或4％胆汁酸孵育2h后，ECN pE(C/ A)2的形态完全没有损伤，而对照ECN-pE的细菌细胞壁受损，这表明双层壳聚糖/海藻酸钠生物膜在胃肠道环境中对益生菌具有良好的保护作用（图2i-k）。用壳聚糖/海藻酸钠生物膜包裹或不包裹ECN-lux对小鼠灌胃3小时后，通过体内成像系统(IVIS)监测ECN-lux的生物发光信号，发现ECN pE(C/ A)2的生物发光信号比ECN-lux高5倍（图2l-n）。采用平板计数法检测小鼠胃、肠、结肠和盲肠中存活ECN-pE的数量，结果发现，与未包裹壳聚糖/海藻酸钠生物膜的ECN-pE相比，给药1小时后小鼠胃中存活ECN pE(C/ A)2的数量几乎高出4倍，而肠、结肠和盲肠内存活ECN-pE(C/A)2的数量也明显高于ECN-pE。上述结果表明，包裹壳聚糖/海藻酸钠生物膜可显著提高ECN-pE在胃肠道中的生物利用度。
图2. ECN-pE和ECN pE(C/ A)2在胃肠道环境中的生存情况
分别使用ECN(C/A)2、ECN-pE(C/A)2、ECN-pE对IBD小鼠进行治疗，发现与对照组(PBS + 3% DSS)相比，ECN-pE(C/A)2处理对DSS诱导的IBD小鼠有明显的保护作用，包括体重减轻、结肠长度缩短和结肠组织损伤等，相比之下，经ECN-pE处理的小鼠因为生物利用率低而不能完全缓解体重减轻和DAI升高的症状 (图3b-h)。此外，经ECN-pE(C/A)2处理的小鼠结肠中IBD相关的MPO活性也显著下降，表明ECN-pE(C/A)2可以有效缓解氧化应激反应(图3i)。ECN-pE(C/A)2处理后小鼠炎症细胞因子水平明显降低，抗炎细胞因子白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β (TGF-β)水平相应上调，进一步证明ECN-pE(C/A)2具有良好的抗炎作用(图3m, n)。
图3. 工程菌ECN-pE(C/A)2对DSS诱导的IBD小鼠的治疗效果
为了探讨肠道菌群在IBD治疗过程中是否发生作用，可以用抗生素预先处理工程菌ECN-pE(C/A)2，然后再用于治疗急性IBD小鼠，结果发现治疗效果明显降低，提示肠道菌群可能在调节急性IBD中发挥重要作用(图5a-g)。通过16S rRNA基因测序分析肠道菌群丰度，结果表明，口服ECN-pE(C/A)2可以显著改变经DSS处理的小鼠肠道菌群的丰度和多样性(图5h, i)，如Lachnospiraceae_NK4A136和Odoribacter的相对丰度，这两种菌可产生丁酸酯，具有抗炎能力，可缓解IBD疾病。另外，经ECN-pE(C/A)2处理过的健康小鼠和DSS诱导的IBD小鼠体内，发现可促进IBD疾病的强毒性病原体Escherichia-Shigella的相对丰度也下降了(图5j-n)。此外，16S rRNA结果显示ECN(C/A)2对DSS处理的IBD小鼠肠道菌群的调节作用不大，说明ECN-pE(C/A)2对肠道菌群的调节作用与过氧化氢酶或超氧化物歧化酶的表达有关。
图4. 工程菌ECN-pE(C/A)2对IBD小鼠肠道菌群的调节
总之，这是一种能够在胃肠道内原位产生抗氧化CAT和SOD的工程益生菌ECN-pE(C/A)2，利用壳聚糖和海藻酸钠生物膜包裹的生物仿生策略来提高益生菌在胃肠道环境中的耐受性，显著提高了口服益生菌的利用度，更重要的是，反复口服ECN-pE(C/A)2后未见不良反应。因此，这种可自主产生功能蛋白并被生物膜包裹的基因工程益生菌对急性IBD表现出安全有效的治疗效果。我们的研究表明，在小鼠模型中口服工程益生菌可以有效地调节炎症和肠道菌群，缓解急性结肠炎。鉴于肠道菌群失调和肠道炎症与许多其他系统性疾病高度相关，益生菌基因工程结合功能性生物膜可能为许多其他疾病的治疗提供方便和有益的平台。
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