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最新观点| 胰蛋白酶降解菌群对新冠病毒感染患者症状的改善

作者:钱伟祎、张勇

胃肠道是人体的主要消化器官,其与饮食、微生物群和宿主衍生分子等密切接触,其中还包括大量消化酶。消化酶核心功能是在肠道将食糜中的大片段营养物质分解成较小成分。然而,在大肠中需要对消化酶功能进行限制。肠道远端蛋白酶水平的增加,如胰蛋白酶,会影响肠道病理状况,与粘膜屏障完整性的破坏和炎症的发生有关。有研究表明,肠道微生物可以通过消耗或改变宿主上游产生的肠腔有害物质,进而维持稳定的肠道环境。但是,对于哪些微生物控制消化酶以及降解机制尚不清楚。

2022年8月,来自日本理化学研究所(RIKEN)Honda和Atarashi团队与美国哈佛医学院麻省总医院Xavier团队的合作,在Nature发表了“Identification of trypsin-degrading commensals in the large intestine”的文章,鉴定出Paraprevotella菌株(同P. clara)能有效降解胰蛋白酶,其可以通过将胰蛋白酶招募并富集于细菌表面,从而促进其自溶和降解。同时临床试验表明P. clara在预防SARS-CoV-2带来的感染和患者腹泻上也起到了一定的作用。

为了探索肠道微生物群对结肠腔内蛋白质(包括消化酶)的影响,作者通过蛋白质组学对无菌 (GF)小鼠和无特定病原体有共生菌 (SPF)的小鼠中收集到的盲肠内容物进行分析,发现GF小鼠相对于SPF小鼠的内容物蛋白含量整体升高,而GF小鼠粪便中的胰蛋白酶(Prss2)水平和活性显著升高。随后,作者测定了胰腺中胰蛋白酶原的产生和肠道不同部位的管腔胰蛋白酶活性,仅在大肠中检测到 GF 和 SPF 小鼠之间的胰蛋白酶水平不同。这些数据表明胰蛋白酶可能受大肠微生物群成员的调节(图1a-g)。

虽然此前有研究提出肠道微生物群具有灭活胰蛋白酶的能力,但特定效应细菌未被鉴定出来。作者采用六名健康日本志愿者(供体A-F)的粪便样本被移植到 GF 小鼠中,来自供体 A、C、D、E 和 F 的粪便微生物群有效地降低了受体小鼠的粪便胰蛋白酶活性。随后作者从供体 C 微生物群受体组中选择了一只小鼠 (C5),并将其盲肠内容物灌胃到一组新的GF 小鼠 (GF+C5小鼠) 中,并采取不同的抗生素干预策略,氨苄青霉素 (Amp)、甲硝唑 (MNZ)、泰乐菌素 (Tyl) 或对照(不含抗生素)进行治疗。在没有抗生素治疗的GF+C5小鼠中,粪便胰蛋白酶活性降低,并且通过Amp治疗进一步降低,而用MNZ或 Tyl治疗消除了这种降低,表明 C5 微生物群含有丰富的胰蛋白酶还原物种(图1h-i)。

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图1.  微生物群介导的大肠胰蛋白酶调节

为了确定真正的效应菌株,作者在厌氧条件培养了一只经 Amp 处理的小鼠盲肠内容物(小鼠C5-Amp#5),并使用16SrRNA 基因测序鉴定出35种独特的菌株。并将35 种分离细菌的混合物(35-mix)引入 GF 小鼠(GF+35-mix)再现了粪便胰蛋白酶活性的显著降低(图2a-b)。随后通过不断的菌种混合组合(14-mix+21-mix,14-mix+9-mix,9-mix+3-mix)对小鼠进行定殖,观察胰蛋白酶活性,并通过各个菌株与重组小鼠胰蛋白酶体外培养,鉴定出Paraprevotella clara是唯一能够减少胰蛋白酶的菌株(图2c-f)。同样,用 2-mix(不包括P. clara从 3-mix)或 34-mix(不包括P. clara从 35-mix)定殖的 GF 小鼠验证了在降低胰蛋白酶活性方面表现出缺陷(图2g-h),最终确认P. clara是35种混合物中的效应菌株。当P. clara与三种已知的人胰蛋白酶同种型一起孵育时,也会发生降解(PRSS1、PRSS2以及PRSS3小程度上降解),而胰蛋白酶降解特性在所有Paraprevotella菌株中都是保守的,但在测试的Prevotella菌株中不存在(图2i-j)。

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图2. 鉴定P.clara 为胰蛋白酶降解物种

为了探究P. clara降解胰蛋白酶背后的机制。作者发现用胰蛋白酶抑制剂(AEBSF、leupeptin 和 TLCK)预处理胰蛋白酶会抑制其被P. clara降解(图3a),这表明降解是由胰蛋白酶依赖性自溶介导的。此外,发现荧光标记的胰蛋白酶积聚在P. clara的表面上(图3b)。

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图3.  鉴定P.clara 介导的胰蛋白酶降解的效应分子

因此,胰蛋白酶降解可能通过P. clara的表面上的相关胰蛋白酶结合分子完成。已知拟杆菌(其中包括Paraprevotella)用复杂的聚糖装饰它们的细胞表面,作者猜测聚糖结合分子是可能的胰蛋白酶结合伴侣。于是便采用衣霉素预处理P. clara从而抑制脂多糖 (LPS) O-聚糖的合成,观察到胰蛋白酶的募集和降解方面表现出缺陷(图3c,d)。有意思的是,这种微生物的外膜分泌系统的抑制从而导致蛋白质丢失的机制,联想到关于LPS缺陷型牙龈卟啉单胞菌突变体的报道,该突变体无法将IX型分泌系统 (T9SS) 依赖性外膜蛋白(例如,牙龈蛋白酶)锚定到表面的LPS上。因此,作者推定出Paraprevotella菌株中的T9SS基因,并设计质粒构建T9SS(PorU)缺陷的突变体P. clara。PorU的破坏导致胰蛋白酶降解的完全缺陷。

作者接下来在衣霉素存在或不存在的情况下对P. clara培养上清液进行了蛋白质组分析,发现 20 种细菌蛋白在衣霉素处理的P. clara的上清液中显着升高(图3f)。因此,后续作者通过插入诱变或通过删除基因簇(Δ03048 - 03053)产生了一系列突变的P. clara菌株,破坏了这些衣霉素敏感蛋白的合成。一系列实验结果表明00502是胰蛋白酶募集和自降解的核心效应成分,而 00509可能在促进胰蛋白酶募集方面起支持作用(图3g-k)。

为了确认00502和00509对体内胰蛋白酶降解的贡献,作者采用野生型 (WT)、Δ00502或Δ00509 的P. clara JCM14859 菌株以及两种胰蛋白酶非降解菌株(2-mix)接种 GF 小鼠。结果表明:Δ00502 P. clara定殖的小鼠保持高粪便胰蛋白酶水平,而Δ00509 P. clara定殖的小鼠显示胰蛋白酶部分减少(图4a,b)。在对免疫分子的影响中,发现与Δ00502或Δ00509 P. clara定殖的小鼠相比,定殖 WT P. clara的小鼠的粪便 IgA 重链(α链)水平显着升高,而κ轻链和抗菌素肽Reg3β几乎没有差异(图4b)。这些数据表明P. clara定殖保护IgA,特别是重链,在体内免受胰蛋白酶的水解切割。另外,即使存在更复杂的微生物群落(34-mix),野生型 P. clara也会降低粪便胰蛋白酶活性,而Δ00502 P. clara没有展现(图4c)。这些数据表明00502在促进体内胰蛋白酶降解方面具有重要作用,并且胰蛋白酶降解的能力赋予细菌在竞争条件下的定殖优势。

有趣地是,研究者发现用野生型 P. clara定殖也降低了粪便中的膜蛋白酶丝氨酸2 (TMPRSS2)含量,这表明P. clara对体内释放的 TMPRSS2 活性形式具有相似的作用(图4b)。而TMPRSS2参与了冠状病毒的刺突蛋白的蛋白水解活化。作者猜测P. clara可能通过降解胰蛋白酶和TMPRSS2 抑制冠状病毒的肠道感染,便采用类似SARS-CoV 和 SARS-CoV-2的小鼠嗜性冠状肝炎病毒2(MHV-2)进行感染,并灌胃GF+2-mix+WT P. clara和 GF+2-mix+Δ00502 P. clara以及复杂微生物背景下的Δ00502(34-mix,34-mix+Δ00502)。通过分析粪便、肝脏和大脑中的病毒拷贝数、生存时间及肝病理学评价,表明P. clara 00502基因的存在和伴随的蛋白酶降解为宿主提供了抵抗 MHV-2 感染的益处。

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图4.  胰蛋白酶的降解由P.clara 介导结肠的平衡状态

另外,小鼠粪便宏基因组数据库挖掘发现00502存在同源物,分布于不同菌种,表明这些物种可能使用的共同机制(图4j)。随后,该研究团队招募了 146 名被诊断出患有 COVID-19的患者,出院后从参与者那里收集粪便样本,并对其进行宏基因组测序。检查了肠道微生物组中00502同源基因的携带与疾病严重程度和腹泻频率之间的关联。作者发现,在00502同源物阴性的参与者中,严重腹泻发作(每天超过两次,持续超过1天)的发生率显著更高(P  = 0.035)(图4k)。此外,肠道微生物组中缺乏00502同源物与更高的吸氧率显著相关(P  = 0.049)(图4l)。尽管需要进一步研究,但数据表明,降解胰蛋白酶的共生定殖菌可能对 SARS-CoV-2 感染提供保护性益处。

总之,该研究表明表明从健康人类供体的粪便微生物组中分离出的Paraprevotella菌株是有效的胰蛋白酶降解共生菌。Paraprevotella通过分泌多糖锚定蛋白将胰蛋白酶募集到细菌表面,以促进胰蛋白酶自溶。Paraprevotella定殖可保护IgA免受胰蛋白酶降解。此外,Paraprevotella定殖可抑制小鼠MHV-2的致死性感染,这是一种依赖胰蛋白酶和胰蛋白酶样蛋白酶进入宿主细胞的小鼠冠状病毒。同样的,肠道微生物组中涉及胰蛋白酶降解的推定基因的携带与 SARS-CoV-2感染患者的腹泻严重程度降低有关。因此,胰蛋白酶降解的共生定殖可能有助于维持肠道稳态和防止病原体感染。另外,胰蛋白酶降解与对SARS-CoV-2感染的保护之间的因果关系需要通过更大的队列和其它动物模型进一步验证。尽管如此,该研究为微生物群介导的蛋白酶调节的机制和生理意义提供了有价值的见解。

原文链接:https://wwwnature.53yu.com/articles/s41586-022-05181-3

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