作者：李依萍、李焕改
维生素 B6 是一种生物体必需的营养元素，包含吡哆醇（PN）、吡哆胺（PM）、吡哆醛（PL）及其磷酸化衍生物5'-磷酸吡哆醇（PNP）、5'-磷酸吡哆胺（PMP）和5'-磷酸吡哆醛（PLP）六种形式。植物和微生物具有维生素 B6 的天然新生物合成途径，但人类和动物必须从外部获取，因此维生素 B6 在制药、食品行业和牲畜饲料中具有很高的商业价值。PLP是维生素 B6 中最活跃的形式，它在氨基酸和糖代谢、血红素合成以及神经递质合成等生化过程中是重要的辅酶；而维生素 B6 中的PN是最常见的商业形式，但目前只能完全依赖化学合成。
近日，中国科学院天津工业生物技术研究所张大伟研究组在国际权威期刊 Nature Communications 发表了题为“Protein engineering and iterative multimodule optimization for vitamin B6 production in Escherichia coli ”的研究论文。该研究以大肠杆菌为底盘细胞，重构维生素 B6 从头合成途径，采用并行通路工程、蛋白工程和迭代多模块优化方式实现高水平 PN 生产。
PNP是维生素 B6 生物合成的直接产物，它通常作为代谢途径酶的辅因子，具有较活跃的催化活性，但是高浓度的PNP对细胞具有毒性。因此，本研究采用生长解耦策略，即在不抑制产物形成的情况下快速积累生物量。运用平行代谢通路方式，利用一种途径生产目标商业化学品PN，而另一种途径则合成细胞生长和维持所必需的PLP（图1）； 通过敲除PNP氧化酶来分离两条途径，阻止PNP转化为PLP，从而使两条途径在同一菌株中代谢正交，而不会相互干扰，既不影响细胞生长又可生产高水平的目标产物PN。
图1. 利用平行代谢途径工程重构维生素B6生物合成途径
生物合成酶的效率直接决定了代谢反应的速率，进而控制通量分布，并最终影响产品的产量。为了增加PN生产的拉力，使产量最大化，该研究采用蛋白理性设计和自然筛选等方法对合成途径起始酶Epd和Dxs以及限速酶PdxA和PdxJ进行异源筛选和理性设计改造，从而提高限速酶的性能（图2）。
图2. 限速酶PdxA和PdxJ的合理设计
PdxB 是参与催化维生素B6生物合成的第二步的烟碱酶， 而SerC为其下游PLP依赖性氨基转移酶。为了进一步提高维生素 B6 的产量，研究者利用PdxB和SerC代谢工程来增加中间代谢途径的通量（图3）。此外，当SerC过表达时，不仅增加PN 生物合成的代谢通量，同时通过空间接近有助于PdxB的多次周转。 最后，研究者采用模块化代谢工程策略，通过将合成通路模块化来重建宿主的代谢平衡，从而实现工程通路表达水平的整体微调。在这项研究中，整个维生素B6通路被划分为上游推力模块和下游拉力模块（图4）。这些模块在4HTP处分离，4HTP是一种有毒中间体。上游模块由Epd、Dxs、PdxB和SerC组成，通过提供足够的DXP和中间4HTP来增强推动力；下游路径由PdxA和PdxJ组成，以增加拉力，实现有效组装和优化。最终在5升生物反应器中对维生素B6高产菌株LL388进行了饲料批量发酵，与之前报告的大肠杆菌菌株相比PN产量增加了18倍。
图3. PdxB和SerC代谢工程
图4. 维生素B6生物合成途径的迭代多模块优化
综上所述，在这项工作中，研究者首先利用维生素B6生物合成途径的平行代谢途径工程，解耦细胞生长所需的PLP和目的产物PN的生物合成；进而通过序列和结构引导的蛋白质工程，改善维生素B6生物合成途径的关键酶，包括起始酶Epd/Dxs和限速酶PdxA/PdxJ；之后进行迭代多模块优化，结合代谢途径基因，并平衡上下模块的表达，以最大限度地提高PN产量；最终的工程大肠杆菌菌株在5升的生物反应器中，通过批量喂食发酵可产生1.4克/升的PN，从而实现PN的从头合成以及高效生产。该研究的迭代多模块优化策略对改善其他有价值的化学品的生产具有良好的参考价值，也为维生素B6的绿色生物生产及其未来的工业化奠定了坚实的基础。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41467-023-40928-0
