图1. 抗叶锈病基因 Lr47 的抗性表型及其精细定位

随后利用改进的MutRNASeq方法鉴定 Lr47 候选基因。研究人员首先从野生型Kern-Lr47 和10个独立的感病EMS突变体进行转录组测序，利用参考基因组TS01和CS候选区间内的同源NLR基因序列，对Kern Lr47 转录组数据库进行BLASTN搜索，鉴定出45类候选转录本；将10个感病EMS突变体的RNA-Seq数据与45个Kern-Lr47转录序列进行对比，发现一个名为KN638873_g379_i12的转录本具有G/C到A/T的突变。进一步PCR验证和基因结构分析，表明KN638873_g379_i12包含一个NLR基因（命名为CNL2），EMS突变体中的点突变导致转录提前终止（图2）。

图2. 利用EMS突变体获得 Lr47 候选基因

由于基于BSMV-sgRNA的基因编辑系统需要预先表达Cas9的品系，利用Kern-Lr47与转入Cas9元件的小麦Bobwhite进行杂交，对F₁植株进行BSMV-sgRNA介导的基因编辑。经系列比对验证，对 CNL2 基因ATG下游2280位敲除了碱基“T”或“TT”的纯合缺失造成 Lr47 的移码突变的2个株系(mut-1和mut-2)进行进一步分析。表型鉴定证实mut-1和mut-2较Kern-Lr47更易感病。进一步将Kern-Lr47 携带 CNL2 的7234 bp基因组DNA片段转化到春小麦品种Fielder中，共获得80个独立的转基因T₀代植株，对T₁转基因家系接种了7个不同叶锈菌小种，转基因阳性植株对叶锈菌都表现出抗性，而阴性对照Fielder完全敏感（图3），进一步证明抗病候选基因即为CNL2。

图3. BSMV-sgRNA诱导的基因编辑和转基因互补验证

由于Kern-Lr47 携带较大染色体片段，CNL2 与一些不利基因相连锁。为进一步对 CNL2 育种应用。利用 ph1b 突变体诱导部分同源染色体7S和7A配对，通过两轮的筛选，分别获得了36 Mb和13 Mb新型短片段易位系（图4）。通过进一步回交，将其转育到我国感锈病小麦品种“扬麦21”（YM21），抗病表型鉴定表明获得的短片段易位系（YM21 + Lr47-1）抗性显著提高。在无病害状态下对BC₃F₃姊妹系进行15个农艺性状评估，发现除了穗长外，其余农艺性状均没有显著性差异（图5）。 

图5. YM21 + Lr47-1 产量和品质性状评估

通过qRT-PCR检测 Lr47 接菌前后的相对表达量，结果显示无明显差异，表明 Lr47  基因的表达水平不受病原菌诱导。烟草叶片和小麦原生质体亚细胞定位结果表明，Lr47蛋白定位于植物细胞质和细胞核中。在烟草叶片中瞬时表达Lr47全长蛋白及包括CC结构域在内的不同肽段，均未观察到明显细胞坏死反应或叶片黄变现象（图6）。

图6. Lr47蛋白抗病分子机制

综上，该研究成功克隆了小麦全生育期广谱抗叶锈病基因 Lr47，丰富了叶锈病抗性的基因资源库。进一步创制了短片段渗入系材料，消除或减少了有害连锁，开发了可用辅助育种的分子标记，为 Lr47 基因在现代小麦育种中的应用提供了有用的工具。