作者：姚端、李焕改
水稻（Oryza sativa L.）是人类重要的粮食作物之一，其耕种与食用历史都相当悠久，全世界有一半的人口以稻为食。油菜素内酯（Brassinosteroids，BR）是一类广泛存在于植物体内的促生长激素，它来源于油菜甾醇或其类似物。根据相关研究我们知道BR可以促进细胞分裂和扩张，调节组织分化，并影响植物对生物和非生物胁迫的耐受性；同时，BR对水稻株型和籽粒形态有重要影响。因此，通过操纵与BR生物合成和信号转导相关的基因，可以帮助水稻获得更可观的产量。
近日，四川农业大学李双成/李平教授团队在The Plant Journal上发表了题为“DWARF AND LOW‐TILLERING 2 functions in brassinosteroid signaling and controls plant architecture and grain size in rice”的研究论文，揭示了水稻GRAS转录因子DLT2与两个BR信号组分DLT和OsBZR1相互作用，共同调控株型、粒型和BR响应的新机制。
研究团队从籼稻9311 EMS诱变库中分离得到 dlt2 突变体，该突变体具有半矮秆株高、分蘖数少、粒宽和粒重增加、BR敏感性降低等特点。通过全自动粒度分析仪分析和显微镜观察，发现 dlt2 突变体的半矮化表型主要是节间细胞大小的改变所导致，并且证实了 dlt2 突变体对BR的敏感性较低（图1）。通过比较野生型（WT）和突变体的籽粒大小，揭示了dlt2突变体籽粒变大的特点。进一步的组织学分析，包括横切面和扫描电子显微镜（SEM）观察，表明 dlt2 突变体比WT颖片表面有更多的隆起和鬃毛，利用实时荧光定量PCR（qPCR）分析得知突变体中两种负粒级调节因子GRAIN SIZE3 （GS3）和GRAIN WEIGHT2 （GW2)的表达下调，而GRAIN SIZE5（GS5）的转录未受影响。总之， dlt2 突变体籽粒表型变宽是由于颖片细胞数量增加导致籽粒纬向生长增强（图2）。
图1. WT和 dlt2 突变体的株型和BR反应对比
图2. WT与 dlt2 突变体的籽粒形态比较
dlt2 突变体与WT杂交实验证明 dlt2 突变是由单一隐性突变引起的。然后，作者使用MutMap方法来定位目的基因，结果发现3号染色体上的一个SNP突变与 dlt2 突变表型相关。F2代的基因型和表现型证实了该突变与 dlt2 突变表型共分离。 dlt2 突变位于LOC_Os03g51330的外显子，该外显子编码水稻GRAS成员，LOC_Os03g51330在 dlt2 突变体中表达上调，可能是由于潜在的反馈调节。利用CRISPR/Cas9系统构建KO（knock-out）突变体，其表型结果再次证明LOC_Os03g51330是 dlt2 突变体的目的基因（图3）。
图3. MutMap和DLT2基因敲除（knock-out，KO）分析
将DLT2融合到绿色荧光蛋白（GFP）的N端，通过在水稻原生质体和烟草叶表皮细胞中瞬时表达表明DLT2在细胞核中表达。烟草叶表皮细胞双荧光素酶实验表明DLT2的N端决定其转录活性，而GRAS结构域不具有转录激活活性（图4）。为了研究DLT2的功能，使用酵母双杂交（Y2H）筛选其互作蛋白，结果显示DLT2与DLT/GS6/SMOS2和OsBZR1互作，后两者是BR信号的两个关键组成部分；DLT2可以与DLT/GS6/SMOS2和OsBZR1在烟草叶表皮细胞核中共定位。使用体内荧光素酶互补成像（LCI）和双分子荧光互补（BiFC）检测来验证相互作用，结果表明，DLT2的存在诱导了DLT/GS6/SMOS2和OsBZR1之间的相互作用。此外，研究发现DLT2可以与自身相互作用，暗示DLT2也可能以同源二聚体或低聚体形式发挥作用（图5）。
图4.DLT2的亚细胞定位和转录活性分析
图5.在酵母和植物细胞中，DLT2与DLT和OsBZR1存在互作
此外，研究团队还分离出一个dlt 的等位突变体，即 dlt-1 ，将 dlt-1 突变引入 dlt2 突变体中，形成双突变体。结果表明，DLT2和DLT/GS6/SMOS2协同调控水稻的株型和粒级；与WT相比，单突变体和双突变体的BR敏感性同样较低，表明DLT/GS6/SMOS2和DLT2也可能以协同方式调控BR反应（图6）。
图6. dlt-1/dlt2 双突变体的表型分析
研究人员证明DLT2与DLT/GS6/SMOS2和OsBZR1互作之后，对DLT2是否会影响它们的活性产生了疑问。通过瞬态D-Luc报告检测和水稻原生质体的表达分析实验，结果显示DLT/GS6/SMOS2在WT中具有较高转录活性，而在 dlt2 突变体中其转录活性明显减弱。此外，在 dlt2 突变体中，OsBZR1对D2启动子的转录抑制作用也大大减弱。这些结果表明，DLT/GS6/SMOS2和OsBZR1的转录活性作用依赖于DLT2（图7）。
图7.DLT2对其互作蛋白转录活性的影响
综上所述，该研究证明DLT2可能参与了一个潜在的转录复合体，从而介导BR信号转导和水稻发育，并表明DLT2可能是改善水稻构型和水稻形态的一个潜在靶点，为研究水稻GRAS蛋白在调控水稻株型和籽粒形态中的作用提供了重要的理论依据。
原文链接：
https://doi.org/10.1111/tpj.16464
